Nước ta ở vùng nhiệt đới gió mùa, có thảm thực vật phong phú và đa dạng vào bậc nhất thế giới. Theo thống kê mới nhất, nước ta có 337 họ thực vật, 2362 chi và 10555 loài. Trong đó đáng chú ý là 3200 loài thực vật được dùng làm cây thuốc để chữa các bệnh khác nhau trong dân gian từ hàng ngàn năm.
Lĩnh vực tinh dầu hương liệu là một lĩnh vực rất lớn của hóa học các hợp chất thiên nhiên. Không những lý thú về nguồn gốc, về phát sinh sinh học, về hoạt tính sinh học mà còn về ứng dụng thực tế cuộc sống như y dược, mỹ phẩm, thực phẩm…. Tiềm năng và ứng dụng của nguồn tinh dầu hương liệu là rất lớn, nhưng thực tế Việt Nam cho đến nay số lượng nguồn tinh dầu mang lại hiệu quả kinh tế lớn chưa nhiều. Do đó, việc nghiên cứu ứng dụng nguồn tinh dầu hương liệu vào thực tế cuộc sống nhằm mang lại hiệu quả kinh tế cao luôn là vấn đề thiết thực và cấp bách hiện nay.
Hai mươi lăm năm trở lại đây, cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Smith) nổi lên như là một hiện tượng và được các nhà khoa học Mỹ, Nhật Bản đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Các nghiên cứu đã chỉ ra hoạt chất Zerumbone từ cây Gừng gió là ứng cử viên số một cho nghiên cứu thuốc mới chống ung thư. Cuối năm 2014, Rahman H.S. và cộng sự đã tổng kết 150 công trình nghiên cứu về Gừng gió và Zerumbone và đã khẳng định Zerumbone ức chế mạnh sự phát triển của 17 loại ung thư khác nhau ở người.
Cây Gừng gió Việt Nam đã được nghiên cứu hoạt tính sinh học và ứng dụng vào thực tế sản xuất thuốc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư ở nước ta.
1. Tổng quan về cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Smith)
1.1. Đặc điểm cây Gừng gió
Họ Gừng (Zingiberaceae) là một họ của thảo mộc sống lâu năm với các thân rễ bò ngang hay tạo củ, bao gồm 47 chi và khoảng trên 1.000 loài. Nhiều loài là các loại cây cảnh, cây gia vị trong chế biến thực phẩm, hay cây thuốc quý. Các sản phẩm chế biến từ chúng được sử dụng rộng rãi ở các nước Đông Nam Á nói riêng và trên toàn thế giới nói chung. Các thành viên quan trọng nhất của họ này bao gồm gừng, nghệ, riềng, đậu khấu và sa nhân. Riêng ở Việt Nam, họ Gừng hiện biết có 21 chi với hơn 100 loài.
Ở mỗi nước, cây Gừng gió được gọi với nhiều tên riêng: Riềng dại, Ngải mặt trời, Ngải xanh (Việt Nam), Khuhet phtu, Prateal vong atit (Campuchia), Gingembre fou (Pháp) và Phong khương (Trung Quốc).
Trong quá trình phát triển ở các vùng lãnh thổ khác nhau, khí hậu khác nhau, nhiệt độ khác nhau loài Gừng gió (Z. zerumbet) có nhiều thay đổi: Có loại Gừng gió hoa màu đỏ; có loại Gừng gió hoa màu trắng; cũng có loại Gừng gió hoa vừa đỏ vừa trắng.
Gừng gió (Zingiber zerumbet Smith)Về nguồn gốc và phân bố, nhiều tác giả cho rằng Gừng gió có nguồn gốc từ Ấn Độ, được người dân nơi đây trồng và tự nhiên hóa tại nhiều nước Châu Á (Sri Lanka, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Malaysia, Indonesia, Philippin, Campuchia, Thái Lan…). Gừng gió là loài cây có nguồn gen đa dạng, sinh trưởng nhanh, chống chịu khỏe, nên có khả năng tự nhiên hóa mạnh. Ở Việt Nam, cây mọc rải rác ở các tỉnh trung du, vùng núi thấp và đôi khi cả ở đồng bằng. Cây ưa ẩm, chịu bóng, thường mọc ở ven rừng và dưới tán rừng kín. ở vùng trung du và đồng bằng, cây mọc lẫn trong các lùm bụi dưới chân đồi hoặc quanh các làng bản.
1.2. Thành phần hoá học của cây Gừng gió
Thành phần tinh dầu của các cây họ Gừng nói chung cũng như các loài Zingiber nói riêng đều rất phong phú. Tuy nhiên thành phần chính vẫn là các chất terpenoid.
Các kết quả nghiên cứu trước đây cũng cho thấy thành phần hoá học chính của cây Gừng gió là các sesquiterpenoid và các dẫn xuất oxy của chúng. Trong đó Zerumbone là dẫn xuất oxi hoá của humulen được biết đến là chất có khả năng ức chế vi khuẩn mạnh và đặc biệt là ức chế được nhiều dòng tế bào ung thư người. Nghiên cứu tinh dầu cây Gừng gió có vai trò quan trọng trong sự phát triển của công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, hương liệu và mỹ phẩm. Các nước đóng góp nhiều nhất trong lĩnh vực này là Pháp, Ấn Độ, Malaysia, Bangladesh. Tất cả các bộ phận của cây Gừng gió đều có tinh dầu. Hàm lượng tinh dầu cũng như thành phần hoá học của tinh dầu ở các bộ phận khác nhau hoàn toàn khác nhau. Ở mỗi bộ phận cây Gừng gió, hàm lượng tinh dầu và thành phần tinh dầu thay đổi theo mùa vụ, vùng trồng, khí hậu và thổ nhưỡng.
Theo đó, khi nghiên cứu củ Gừng gió vùng Bình Trị Thiên (BTT), Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự khẳng định rằng tinh dầu củ Gừng gió vùng này điều chế theo phương pháp cất cuốn hơi nước cho hiệu suất 0,25%. Thành phần hoá học của tinh dầu củ Gừng gió ở vùng BTT được phân tích GC-MS cho thấy, tinh dầu củ Gừng gió BTT có 7 thành phần chính, trong đó thành phần có hàm lượng lớn nhất là Zerumbone chiếm 72,3% khối lượng tinh dầu, sau đó là humulen chiếm 4,2%. Hầu hết các thành phần chính là sesquiterpen chiếm 88,2% tổng lượng tinh dầu. Nếu so sánh hàm lượng Zerumbone trong tinh dầu cây Gừng gió BTT với tinh dầu Gừng gió Bang Kerala Miền Nam Ấn Độ thì thấp hơn (hàm lượng Zerumbone trong tinh dầu vùng này là 76,3-84,8).
Đặc điểm của cây Gừng gió là thân thảo mềm, thân gắn liền với lá nên khi khai thác thường khai thác thân lá với nhau. Do đó việc nghiên cứu tinh dầu là nghiên cứu chung cho cả thân và lá. Trong một công bố khác vào năm 1995, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự đã điều chế tinh dầu thân lá Gừng gió BTT bằng phương pháp cất cuốn hơi nước, kết quả phân tích thành phần bằng GC-MS cho thấy hàm lượng Zerumbone trong thân và trong lá chiếm lần lượt 21,3% và 2,4 % khối lượng tinh dầu. Cũng theo phương pháp này, hơn 40 hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu hoa Gừng gió sinh trưởng vùng BTT (chiếm khoảng 85% tinh dầu), trong đó Zerumbone chiếm 3,2% tổng hàm lượng tinh dầu.
Kết quả nghiên cứu thành phần hoá học củ, thân lá và hoa Gừng gió vùng BTT cho thấy một điều thú vị là thành phần β-caryophynen và Zerumbone đều có trong thành phần tinh dầu của tất cả các bộ phận này. Trong đó hàm lượng Zerumbone là cao nhất trong củ, sau đó là thân lá và cuối cùng là hoa.
Nếu như tinh dầu Gừng gió vùng BTT có hàm lượng Zerumbone thấp hơn tinh dầu Gừng gió Bang Kerala Miền Nam Ấn Độ, thì khi nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu cây Gừng gió vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc chúng tôi nhận thấy hàm lượng Zerumbone cao hơn khá nhiều. Theo đó, chúng tôi đã xây dựng qui trình phân lập Zerumbone từ tinh dầu có độ tinh khiết cao và hiệu suất tốt, đã nghiên cứu hoạt tính chống vi khuẩn và chống ung thư cả in vitro và in vivo. Kết quả cho thấy, tinh dầu của Gừng gió vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc điều chế theo phương pháp cất cuốn hơi nước trong thiết bị đặc biệt có hiệu ứng muối cho hiệu suất gần 1,4% tính theo nguyên liệu tươi. Tinh dầu có chất lượng tốt, màu vàng chanh, mùi dễ chịu và khi để lạnh thì kết tinh Zerumbone. Sau khi lọc thu tinh thể Zerumbone, tinh dầu được phân tích GC-MS, kết quả được cho trong Bảng 1.
Kết quả cho thấy hàm lượng Zerumbone chiếm 50,3%. Nếu tính cả lượng Zerumbone đã lọc thì hàm lượng Zerumbone trong tinh dầu Gừng gió vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc lên đến 89,7%. Nếu đánh giá tinh dầu dựa theo hàm lượng Zerumbone thì rõ ràng tinh dầu vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc có chất lượng tốt hơn tinh dầu Gừng gió vùng BTT và Bang Kerala Miền Nam Ấn Độ.
Bảng 1: Thành phần hoá học tinh dầu củ Gừng gió vùng Tam Đảo – Vĩnh Phúc sau khi đã tách Zerumbone kết tinh
TT
Tên chất
Hàm lượng (%)
TT
Tên chất
Hàm lượng (%)
1
Camphen
0,08
17
α-Selinen
0,06
2
1,8-Cineol
0,14
18
α-Muurolen
0,06
3
Linalool
0,68
19
α-Amorphen
0,07
4
Gamphor
2,00
20
δ-Cardinen
0,22
5
Exo-methylcamphenilol
0,08
21
E-12-Norcariophyll-5-en-2-on
1,04
6
Bicyclo [2,2,1]heptan-2-ol
0,08
22
Elemel
0,13
7
1-Borneol
0,67
23
Cariophylen oxit
4,64
8
Terpinen-4-ol
0,23
24
α-Thuyon
1,13
9
1-α-terpineol
0,66
25
Bicyclo[4,1,0]-heptan
2,89
10
Bornylaxetat
0,16
26
β-Eudesmol
0,85
11
α-Camphaen
0,06
27
2-cyclohexen-1-on
1,47
12
β-Element
0,07
28
α-guaien
0,12
13
Cis- Cariophyllen
0,06
29
Zerumbone
50,3
14
Trans-Cariophyllen
1,65
30
1,2-benzendicarboxylic acid
0,12
15
α-Humulen
16,89
31
Hexadecanoic acid
0,15
16
Cis-α-Bisabolen
0,08
1.3. Hàm lượng Zerumbone trong cây Gừng gió
Zerumbone (1) hay (2E,6E,10E)-2,6,9,9-tetramethyl-cycloundeca-2,6,10-trien-1-one được Dev S. và cộng sự phân lập từ tinh dầu củ cây Zingiber zerumbet vào năm 1956 [22]. Zerumbone có công thức phân tử C15H22O, khối lượng phân tử 218,3, là tinh thể hình kim màu trắng có nhiệt độ nóng chảy 65,3 oC, nhiệt độ sôi 321-322oC/760mmHg. Zerumbone tan tốt trong các dung môi như ethanol, DMSO, trong nước ở 25 oC nó có độ tan 1,296 mg/L.
Zerumbone là một sesquiterpen đơn vòng 11 cạnh, trong cấu trúc có chứa 3 liên kết đôi; 1 liên kết đôi độc lập ở C6, 2 liên kết đôi ở C2 và C10 cùng với nhóm C=O tạo thành hệ dienon liên hợp. Trong đó, liên kết đôi ở C2 là ít bị cản trở nhất do nó cách xa nhóm thế gem-dimethyl ở C9 nhất. Cấu trúc tia X cho thấy hệ dienon nằm trong một mặt phẳng hơi méo và vuông góc với mặt phẳng chứa liên kết đôi độc lập ở C6 .
Công thức cấu tạo của Zerumbone.
Khi chúng tôi nghiên cứu hàm lượng Zerumbone trong tinh dầu củ Gừng gió tại 5 tỉnh khảo sát gồm Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, Lào Cai, Hà Tây, Sơn La, kết quả cho thấy hàm lượng Zerumbone cao nhất trong tinh dầu củ Gừng gió tại Vĩnh Phúc đạt 89,7% [26]. Bảng 2 sau đây liệt kê hàm lượng Zerumbone trong tinh dầu cây Z. zerumbet ở một số vùng trên thế giới.
Bảng 2: Hàm lượng Zerumbone trong tinh dầu cây Z. zerumbet ở một số vùng trên thế giới
Vùng lãnh thổ
Bộ phận cây
Hàm lượng Zerumbone (%)
Ấn Độ
Thân rễ
76,3-84,8
Malaysia
Thân rễ
68,9
Bình Trị Thiên
(Việt Nam)
Thân cây
21,3
Lá
2,4
Hoa
3,2
Bình Trị Thiên
(Việt Nam)
Thân rễ
72,3
Vĩnh Phúc
(Việt Nam)
Thân rễ
89,7
Đảo Polynesia (Pháp)
Thân rễ
65,3
Đồi Reunion (Pháp)
Thân rễ
37,0
Bangladesh
Thân rễ
46,8
2. Các phương pháp phân lập Zerumbone từ cây Gừng gió
Mục tiêu của các phương pháp phân lập Zerumbone từ củ cây Gừng gió là thu được Zerumbone với hiệu suất tốt, đạt độ tinh khiết trên 98% để làm dược liệu, mang lại hiệu quả kinh tế cao, là cơ sở để áp dụng vào thực tế sản xuất. Qua tham khảo các tài liệu đã công bố, có thể chia các phương pháp phân lập Zerumbone thành 2 nhóm.
2.1. Phân lập Zerumbone bằng phương pháp chiết
Đi từ nguyên liệu củ Gừng gió tươi: Nghiền củ Gừng gió tươi rồi chiết bằng MeOH hay EtOAc, loại dung môi thu cặn chiết, Sắc ký cột cặn chiết để thu được Zerumbone [27]. Hiệu suất toàn bộ quá trình này không vượt quá 0,1% tính theo nguyên liệu tươi. Cũng theo phương pháp này, tác giả Abdul và cộng sự chỉ thu được Zerumbone với hiệu suất 0,062% tính theo nguyên liệu tươi [2].
Đi từ nguyên liệu củ Gừng gió khô: Nước trong củ Gừng gió tươi ngăn cản việc chiết tinh dầu bằng dung môi không phân cực. Vì vậy người ta thái mỏng củ Gừng gió, phơi khô, nghiền nhỏ và chiết bằng dung môi sau đó loại bỏ dung môi thu cặn chiết và Sắc ký cột để thu được Zerumbone. Theo cách này Uraiwan Songsiang và cộng sự thu được Zerumbone với hiệu suất 0,37% tính theo nguyên liệu khô, nếu tính theo nguyên liệu tươi là 0,03% [28].
Như vậy, phương pháp này cho hiệu suất thấp 0,03-0,062% tính theo nguyên liệu tươi, phải tiến hành sắc ký cột để tách Zerumbone vừa tốn kém vừa khó công nghiệp hoá do hiệu quả kinh tế thấp.
2.2. Phân lập Zerumbone qua tinh dầu
Từ củ Gừng gió tươi, Hitayama và cộng sự đã điều chế tinh dầu, rồi phân lập ra Zerumbone từ tinh dầu, tuy nhiên hiệu suất thu tinh dầu chỉ đạt 0,1-0,3%]. Cũng theo cách này Salaiman và cộng sự cũng thu được tinh dầu với hiệu suất thấp đạt 0,2%.
Trong đề tài cấp Nhà Nước mã số CNHD-ĐT.018/10-11, Chúng tôi đã xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất Zerumbone có độ tinh khiết 99,5% với hiệu suất 0,35% từ củ Gừng gió tươi vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc. Qui trình được thực hiện như sau: Nghiền nhỏ củ Gừng gió tươi, rồi cất cuốn hơi nước trong thiết bị đặc biệt có hiệu ứng muối (NaCl) có bẫy tinh dầu bằng dung môi, sau đó chiết dịch cất với dung môi n-hexan , loại dung môi thu tinh dầu và để kết tinh phân đoạn tinh dầu thu được Zerumbone. Rõ ràng so sánh với các phương pháp khác, phương pháp này là phương pháp đơn giản, có hiệu suất tốt, hiệu quả kinh tế cao và có khả năng ứng dụng vào thực tế để sản xuất Zerumbone tại Việt Nam.
Với qui trình này chúng tôi đã thu được Zerumbone từ củ Gừng gió do Dự án cung cấp đạt hiệu suất 0,35% tính theo nguyên liệu tươi. Sản phẩm có điểm nóng chảy 64-65 oC, có Rf = 0,65 (dung môi n-hexan/EtOAc 19/1) và đạt độ tinh khiết 99,5% theo HPLC-MS sử dụng chất chuẩn Zerumbone của hãng Sigma Aldrich. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và phổ hai chiều 2D NMR đã khẳng định chính xác cấu trúc Zerumbone đã điều chế được.
3. Hoạt tính sinh học của Zerumbone và các dẫn xuất của chúng
Trong 35 năm trở lại đây, hoạt tính sinh học của Zerumbone được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu cả in vitro và in vivo cho thấy Zerumbone có hoạt tính chống ung thư, chống viêm, chống oxi hoá, bảo vệ gan, tăng cường miễn dịch, chống xơ vỡ động mạch, giảm đau và kháng khuẩn. Trong đó hoạt tính chống ung thư và chống tái phát ung thư được nghiên cứu nhiều nhất. Năm 2014, Rahman H. S. và cộng sự đã tổng kết 150 công trình nghiên cứu cây Gừng gió và hoạt tính chống ung thư của Zerumbone phân lập từ cây Gừng gió và nhận thấy Zerumbone ức chế mạnh sự phát triển của 17 loại ung thư người khác nhau như ung thư gan, ung thư tử cung, ung thư phổi, ung thư vú , ung thư đại tràng, ung thư tụy , ung thư buồng trứng , ung thư da, ung thư P-388D1, ung thư máu.
Tác dụng chống ung thư của Zerumbone còn có tính chọn lọc cao. Zerumbone chỉ có tác dụng độc với tế bào ung thư, không có tác dụng độc với tế bào thường.
Đến nay, nhiều tính chất hóa học của Zerumbone vẫn được nghiên cứu để khai thác triệt để tính sẵn có và linh hoạt của hợp chất này như là một nguyên liệu ban đầu để tổng hợp nhiều hợp chất hữu dụng khác. Không chỉ Zerumbone mà cả các dẫn xuất của chúng cũng có những hoạt tính sinh học đáng chú ý
Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc đối với 5 dòng tế bào ung thư người (gồm ung thư phổi LU-1, ung thư gan Hep-G2, ung thư vú MCF7, ung thư bạch cầu cấp P338 và ung thư đại tràng SW480) của dẫn xuất của Zerumbone là các tổ hợp của azazerumbone với các chalcon, chúng tôi đã kết luận rằng các dẫn xuất của Zerumbone này đều thể hiện hoạt tính gây độc mạnh trên cả 05 dòng tế bào ung thư người. Tất cả các sản phẩm lai ghép đều có hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh hơn hoạt tính gây độc tế bào ung thư của Zerumbone đối với cả 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm từ 2 đến 16 lần.
Năm 2004, trong công trình nghiên cứu về hoạt chất chống ung thư và HIV từ cây cỏ Việt Nam, chúng tôi đã chiết tách Zerumbone từ củ cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) vùng Tam Đảo – Vĩnh Phúc và khảo sát hoạt tính chống ung thư in vitro đối với 3 dòng ung thư người Hep-2, RD, KB; kết quả cho thấy Zerumbone ức chế mạnh đối với sự phát triển của dòng ung thư biểu mô KB, ung thư màng tim RD và ung thư gan Hep-2 .
Các kết quả nghiên cứu trong năm 2005 của chúng tôi cho thấy Zerumbone không những chống lại sự phát triển ung thư báng Sarcoma 180 in vivo mà còn phòng ngừa tái phát ung thư này ở giai đoạn hậu phẫu thuật. Và đây cũng là lần đầu tiên phát hiện hoạt tính phòng ngừa tái phát ung thư của Zerumbone.
Trong dự án sản xuất thử nghiệm cấp Nhà Nước mã số CNHD.DASXTN.011/13-15, Chúng tôi đã xây dựng quy trình công chế sản xuất viên nang Zerumboner từ thành phần chính là Zerumbone với độ tinh khiết 99,5%. Theo đó viên nang Zerumboner được dùng dưới dạng thực phẩm chức năng có tác dụng chống và phòng ngừa ung thư. Đây là tiền đề cho các thử nghiệm lâm sàng tiếp theo với mục tiêu sử dụng Zerumboner như là thuốc chống ung thư.
Kết luận
Chúng tôi đã khảo sát hàm lượng tinh dầu các loại Gừng gió (Zingiber zerumbet Smith) ở nước ta gồm 6 tỉnh miền núi Bắc Bộ và 3 tỉnh Bình Trị Thiên, kết quả cho thấy Gừng gió trồng ở vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc là loại tốt nhất, với hàm lượng tinh dầu và Zerumbone là cao nhất (89,7%).
Đã hoàn thiện quy trình công nghệ điều chế tinh dầu từ củ Gừng gió tươi trồng ở vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc đạt hiệu suất cao (1,4 % tính theo nguyên liệu tươi). Đã xây dựng được quy trình đơn giản và hiệu quả để phân lập Zerumbone từ tinh dầu củ Gừng gió tươi với hiệu suất tốt (0,35%) và độ tinh khiết cao (99,5%) dùng làm nguyên liệu cho dược phẩm.
Đã hoàn thiện nghiên cứu quy trình trồng Gừng gió ở vùng Tam Đảo – Vĩnh Phúc, đây là nguồn nguyên liệu lớn cung cấp cho dự án sản xuất thử nghiệm.
Đã hoàn thiện nghiên cứu sản xuất viên nang Zerumboner và đã được Bộ Y tế cấp phép sản xuất dưới dạng thực phẩm chức năng phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư. Hiện nay Zerumboner đang được sản xuất tại Công ty cổ phần dược phẩm Bắc Ninh.
Tất cả các nội dung trên được thực thiện qua đề tài cấp Nhà nước mã số CNHD-ĐT.018/10-11 và dự án sản xuất thử nghiệm cấp Nhà nước mã số CNHD.DASXTN.011/13-15 thuộc chương trình nghiên cứu KHCN trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020 của Bộ Công Thương.
